GT115 Chemically Competent Cell

基因型：

F- mcrA?(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15?lacX74 recA1rpsL (StrR) endA1 ?dcm uidA(DMluI)::pir-116?sbcC-sbcD

簡要說明：

GT115菌株，是專門用來克隆含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）或重復(fù)序列等DNA二級結(jié)構(gòu)的基因序列的大腸桿菌菌株。大腸桿菌中存在一種SbcCD蛋白復(fù)合體，可以識別DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并將其切除；將sbcC和sbcD兩個(gè)基因突變，增強(qiáng)了發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的穩(wěn)定性。同時(shí)在大腸桿菌基因組中引入uidA(DMluI)::pir-116，使GT115可以表達(dá) 兀 蛋白，含有R6Kgori復(fù)制子的質(zhì)粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常復(fù)制。rpsL賦予GT115lian霉素抗性，同時(shí)該菌株還含有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recA)突變，增強(qiáng)了外源DNA的穩(wěn)定性。GT115感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×108 cfu/μg DNA。

操作說明：

1. 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的 DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物） 并用手bo打 EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25 分鐘。

2. 42℃水浴熱激 45秒，迅速放回冰上并靜置 2分鐘，晃動(dòng)會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌SOC 或LB培養(yǎng)基，混勻后 37℃，200 rpm復(fù)蘇 60分鐘。 

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取 100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的 SOC 或 LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng) 6.5 小時(shí)以上

注意事項(xiàng)：

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8 分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長，長時(shí)間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入目的 DNA 時(shí)應(yīng)輕柔操作。 

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。